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乳腺生物反應器表達產物的分離純化
乳腺生物反應器技術是利用雌性動物產仔後乳腺分泌乳汁的特點,以乳腺特異表達的乳蛋白基因的調控序列構建外源基因表達載體,製作轉基因動物,指導外源基因在動物乳腺中特異高效地表達,繼而從轉基因動物乳汁中獲得外源性重組蛋白的一種轉基因技術。20世紀80年代,乳腺生物反應器技術逐漸興起。國際上相繼出現了美國的 GTC(Genzyme Transgenics)、英國的 PPL(PPL-Therapeutics)、荷蘭的 PBV(Pharming BV)、日本的Somitomo Metals、加拿大的Nexia等以乳腺生物反應器技術為核心的公司。我國對乳腺生物反應器的研究起步較早,1983年,中國科學院上海細胞生物學研究所施履吉院士首次提出利用轉基因動物乳腺生產重組蛋白的構想,並在國內率先獲得表達乙肝病毒表麵抗原的轉基因兔,為中國乳腺生物反應器研究奠定基礎。上海醫學遺傳研究所、複旦大學遺傳所、中國農業大學農業生物技術國家重點實驗室、青島森淼實業有限公司、上海傑隆生物工程股份有限公司等科研單位和企業先後在人凝血因子IX、人乳鐵蛋白、人抗凝血酶III等重組蛋白的研發和產業化工作。
自2006年8月全球第一個通過乳腺生物反應器生產的藥物 ATryn (重組人抗凝血酶III)批準上市以來,已有越來越多的重組蛋白進入臨床研究和上市銷售。乳腺生物反應器技術具有表達量高、成本低廉、表達產物活性高等諸多優點,已經成為生物反應器研究中最具有發展前景的領域之一,但其表達產物的分離純化步驟依然是製約該技術產業化的主要瓶頸之一。
一、分離純化的難點
乳腺生物反應器分泌的乳液成分非常複雜,給重組目標的分離純化帶來嚴峻的挑戰。分離純化的難點主要體現在如下3方麵:1)乳液成分複雜,含有大量的酪蛋白膠體、脂類顆粒以及乳糖等多種雜質,對介質的汙染和蛋白的有效吸附與分離造成極大的負麵影響;2)目標蛋白含量低,表達量通常在0.1-5 mg/ml的水平,而牛、羊乳汁中蛋白質、脂肪、乳糖等物質的含量高到13%左右(約130 mg/ml);3)乳液中存在和重組蛋白同源的蛋白質(如乳鐵蛋白),以及和重組人源化單克隆抗體結構和性質相似的牛或羊抗體,純化難度極大。如何克服上述困難,篩選合適的原料預處理方法、設計和優化高效的分離純化工藝、開發高效的介質清洗方法,是實現乳腺生物反應器表達的重組蛋白高效純化和實現產業化的關鍵所在。
二、分離純化實例剖析
乳腺生物反應器表達的重組蛋白種類繁多,純化步驟和難點更有所不同。本文選取幾種具有代表性的重組蛋白為例,分別介紹其分離純化方案,為其它重組蛋白的分離純化方案設計提供借鑒和參考。
1、重組人抗凝血酶III
作為全球第一個上市的乳腺生物反應器表達的重組蛋白產品,重組人抗凝血酶III的分離純化具有重要的參考意義。早期的人抗凝血酶III主要從人血漿中提取,肝素親和層析是其中純化效果最高的核心步驟。乳腺生物反應器表達的重組人抗凝血酶III的分離純化,同樣是基於以肝素親和層析為核心的多步組合層析。GTC 公司的Edmunds等建立了1條由切向流過濾、肝素親和層析、超濾脫鹽、陰離子交換層析、疏水層析和超濾濃縮6個單元操作(含3步層析)組成的分離純化工藝,最終以53%的目標蛋白收率實現了高純度樣品的製備,並於2006年成功實現產品的上市。
青島森淼實業有限公司是我國最早從事乳腺生物反應器技術研發和重組人抗凝血酶III產品開發的企業之一。在成功實現重組蛋白高效表達的基礎上,2008年起與中科院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室合作,共同開展重組人抗凝血酶III高效分離純化工藝開發、中試放大和產品鑒定等研究工作。針對原有純化工藝存在的操作步驟多、純化周期長、產品收率低的不足,建立了1條基於等電點沉澱(快速去除酪蛋白等雜質,實現樣品的高效預處理)和肝素親和層析(純化目標蛋白)的純化工藝;在此基礎上,利用腸激酶切除β-酪蛋白分泌肽,並采用凝膠過濾層析實現了分泌肽的有效去除,最後進行超濾濃縮。在係統研究pH值、洗脫梯度、上樣量、操作流速等因素對分離純化效果影響的基礎上,新工藝大大簡化了操作步驟、提高了產品收率(目標蛋白收率90.3%);並進一步采用中科院過程工程研究所國家生化工程技術研究中心研製的肝素親和層析介質(在中科森輝微球技術(蘇州)有限公司實現產業化)進行了50批次的小試實驗,以及3批次中試放大實驗(10L規模的肝素親和層析柱),進一步降低了分離純化成本、推動了產業化進度。
2、重組人CD20抗體的分離純化
牛乳腺生物反應器可以高效表達重組人單克隆抗體,但牛乳中的蛋白質雜質種類較多,特別是牛自身表達的多克隆抗體,與重組人抗體的結構以及物理、化學性質均非常相似,分離難度很大,對重組抗體的分離純化提出了嚴峻的挑戰。以重組人CD20抗體為例,Grunfeld等采用混合模式的色譜技術分離混合抗體,取得了一定的分離效果,但這種利用抗體疏水性進行分離的方法通用性有限,無法解決所有混合抗體分離的問題。Pollock等提出了可通過親和色譜分離純化乳腺生物反應器表達的重組抗體分子,但並未報道其產品中動物抗體的殘留量。
根據重組人抗體與牛抗體恒定區的種屬差異會導致它們與Protein A配基之間的親和力強弱存在一定的差異的原理,中科院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室蘇誌國研究團隊采用自行開發的Protein A親和層析介質(目前已在中科森輝微球技術(蘇州)有限公司實現產業化),利用親和層析的方法對對重組人CD20抗體進行了純化。初期研究發現,采用傳統的梯度洗脫模式,並不能實現兩種不同來源抗體的有效分離,盡管電泳結果顯示抗體純度達到電泳純,但ELISA分析結果表明重組人CD20抗體還含有高達17.1%的牛抗體;進一步研究發現,在合適的高上樣量條件下,采用置換色譜模式(重組人抗體與牛抗體競爭結合到親和介質上)可以將牛抗體的殘餘量降低到0.82%的低水平。
為進一步提高抗體純化技術的通用性,蘇誌國研究團隊進一步發展了免疫親和層析方法,以羊抗人(CD20)單抗為親和配基製備了免疫親和層析介質,實現了重組人CD20單抗的高效純化,並將牛抗體的殘餘量降低到0.2%的極低水平。免疫親和層析方法具有通用性,同樣適用於其它重組抗體的分離純化。
3、重組人乳清白蛋白和乳鐵蛋白的分離純化
通過核移植和體細胞克隆技術成功地在牛乳中表達了重組人乳清白蛋白( recombinant human а-lactalbumin, rHLA),但重組牛乳中的蛋白雜質種類較多,除了大量的酪蛋白膠束之外,還存在多種牛乳清蛋白,如免疫球蛋白、β-乳球蛋白和牛乳清白蛋白( bovine а-lactalbumin,BLA) 等,其中後者是純化目標產物rHLA的同源蛋白質,兩者的氨基酸序列、結構以及物化性質均非常相似,對重組rHLA的分離純化提出了嚴峻的挑戰。除了采用常規的三步純化策略或者試錯法(trial-and-error)來開發分離純化工藝外,根據目標蛋白特性及其與其他雜質的差異進行理性的工藝設計是一條更加有效的途徑。
蛋白的表麵性質主要包括電荷和疏水性,可采用GRASP II軟件計算蛋白的表麵電勢,以及通過如下公式計算蛋白表麵平均疏水性(Average surface hydrophobicity, ASH)。通過比較可以看出,兩種蛋白的疏水性差異約為8.9%,表麵電勢差異為21.3%。分別采用疏水層析和離子交換層析進行實際的分離,結果發現疏水層析的分離效果優於離子交換層析,原因在於蛋白的層析行為不僅與其表麵的平均性質相關,蛋白表麵上的疏水基團和電荷的分布影響更加重大。

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